概日リズムを持つ原核生物

概日時計を有する生物は数多く報告されているが，我々のグループは現在のところシアノバクテリアを選択している．(図1)シアノバクテリアは生命進化の初期に水を分解する光合成機能を獲得し、その後の多様な生命進化を可能した生物である。この生物は核をもたない原核生物であるが、光合成に依存した生活を営むため時計機能を持っており、最も単純なモデル生物として好都合であった．

図１：シアノバクテリアの顕微鏡写真

シアノバクテリアの生物時計をみる シアノバクテリアの示す様々な生命現象のうち，恒明条件化で概日リズムを示すことが知られているのは光合成活性，窒素固定活性などである．こうした生理学的な観察をする方法もあるが，我々のグループはある概日リズムを刻むことがすでにわかっている遺伝子の発現をリアルタイムに観察している．シアノバクテリア自身の生物時計はシアノバクテリアのなかには遺伝子操作の容易な種(Synechococcus PCC 7942)があり、これに概日時計に制御されるよう仕組んだ生物発光酵素の遺伝子を移入した。このシアノバクテリアの発光を計ることで概日時計の動きを容易にモニターする．生物発光はもちろん連続して何日も計測しなければならないが，自動的に長時間の計測をしてくれる近藤先生お手製の測定装置を用いて簡単に測ることができる(図2)．（噂によればこの装置は時間生物学業界ではコンドートロンと呼ばれているらしい)

図２：生物発光測定装置

シアノバクテリアの時計関連遺伝子

近藤研の初期の研究は，シアノバクテリアの遺伝子の中から概日時計と関わっている遺伝子（時計関連遺伝子とよぶ）を探すことであった．先ほど述べた生物発光リズムは寒天上に成育した多数のコロニーでも観測することができるので、容易にリズム突然変異を分離することができた。これらの変異体では概日時計に不可欠な遺伝子が異常をおこしていることが考えられるため、石浦博士（現遺伝子実験施設）らとともに、この遺伝子を突き止めようとした。まず正常なゲノムを小さな断片に分解し、1つずつ突然変異体の細胞に導入する。もし突然変異を起こした遺伝子に相当する正常な遺伝子含むゲノム断片が入れば、リズムは元に戻る。これが見つかればそのなかに時計遺伝子が存在するはずである。こうして3つの遺伝子からなる時計遺伝子群kaiABC（回転にちなんでkaiと命名した）が見つけられた．またその後も突然変異体の観察から時計遺伝子を探す試みは続けられた．2007年現在我々のグループからはsasA, rpaA, labA, と名付けられている三つの遺伝子が時計関連遺伝子であると報告されている．また他のグループからもいくつかの遺伝子が報告されている．

転写翻訳ネガティブフィードバック説とKaiC

そもそも生物時計はいかなる分子的なメカニズムにより生じるのであろうか？多くの生物において今のところ支持されている説は"転写翻訳ネガティブフィードバック説"である(図3)．

図３：転写翻訳ネガティブフィードバック説

これは，ある遺伝子から発現したタンパク質がある時間経過した後に，その遺伝子自身の発現を抑えるというモデルである．このモデルが何故振動するかは頭の中で少し状況をシミュレーションしてみる必要がある．ある時計遺伝子がまず発現しタンパク質を生産したとする．時計タンパク質は少しの時間をおいた後，今度は自身の発現を抑制するので遺伝子発現はストップする．そのうち時計タンパク質は分解し量が徐々に減ってくる．そうするとまた時計遺伝子の発現が開始され，最初の状態にもどる(図4).

図４：ネガティブフィードバックが振動を生み出す

ちなみに，タンパク質の量を一定に保つ目的でもネガティブフィードバックループは使われることがある．タンパク質量を保つメカニズムにも振動させるメカニズムにもなりうるネガティブフィードバックは，なんでも説明できてしまう眉唾の理論ではなく，この二つを分け隔てる鍵は"時間遅れ"にある．もし，時間遅れがなく自身を抑制するような系であれば振動せず，適切な時間遅れが振動を生むことは数理的に説明されている． 他の生物ですでに報告されていたと時計関連遺伝子はよくこのモデルに適合した．またシアノバクテリアの場合はkaiCがこのモデルに適合し，kaiCを中心とした転写翻訳ネガティブフィードバックループモデルが振動を生み出すと考えられた(図5)．

図５：KaiCによるネガティブフィードバックループ

KaiCリン酸化リズムの発見と転写翻訳ネガティブフィードバック説への疑い

KaiCの遺伝子発現制御とは別に，KaiC自身の生化学的性質への研究も同時に進められた．その過程でKaiCは細胞内においてATPを加水分解し自身をリン酸化することが明らかになった．このリン酸化反応とKaiA, KaiBタンパク質は関係しており，kaiA, KaiBの新たな役割も浮かび上がった．また重要なことは細胞内においてリン酸化されたKaiCの割合が24時間周期で変動している,すなわち概日リズムを刻んでいることである．

この"KaiCのリン酸化のリズム"に対して，2004年頃，不思議な現象が観察された．シアノバクテリアは恒暗条件下でほとんどの遺伝子発現がストップすることがわかっていた．その条件下でもあいかわらずKaiCのリン酸化のリズムは継続していることがわかった．すなわちこのリン酸化リズムは転写翻訳ネガティブフィードバックとは関わらずに存在していることが示唆される．シアノバクテリアにおいては転写翻訳ネガティブフィードバックモデルではなく，KaiCのリン酸化リズムが概日リズムを生み出す装置そのものではないかとの推測がこの結果からなされた．

KaiCリン酸化リズムの試験管内再構成

細胞内における不思議なKaiCタンパク質のリン酸化リズムの振る舞いから間もない2004年秋ごろ，我々のグループにおいてリン酸化リズムそのものが試験管内で再構成された．しかもその系は極めてシンプルであり，KaiCのほかに必要なものはKaiAとKaiBタンパク質，それとATPだけであった．これは，タンパク質間の相互作用のみからKaiCのリン酸化リズムが自律的に振動する能力が存在することを指し示すものであり，KaiCのリン酸化リズムがシアノバクテリアの概日時計の中心であるということをさらに支持する結果である．細胞内では，KaiCのリン酸化のレベルを検知して各種の遺伝子発現制御を行っているというモデルが今のところ細胞の概日リズムを生み出すメカニズムとして有力である(図6)．

この系は一方でBZ反応のような，一定環境下で自律的に駆動する化学振動子としての側面も持っている．生物時計だけの問題ではなく，純粋な化学，物理学の問題としてとらえても解くべき謎は多い．我々のグループだけではなく，多くのグループがこの系に着目し研究を開始したところである．

図６：KaiCリン酸化リズムが細胞全体の概日時計を駆動する

現在の我々のグループの研究

試験管内のKaiCのリン酸化リズムにターゲットを絞り，生物時計の周期決定メカニズム，振動の発生要因をつきとめることを目指している．Kaiタンパク質間の相互作用の時間変化，リン酸化反応のさらに基礎としてATPase反応(ATP加水分解反応)が存在すること，KaiCの二つのリン酸化サイトの役割を決定するなど，素反応の同定を進めている．また構造生物学，数理生物学などの他分野と協力し，総力戦でこの分子機械の理解に挑んでいるところである．

執筆: H.I.